精氨酸激酶（AK）的提取与纯化张纯洁（湖北师范学院生物系 湖北黄石 435002）摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。
重组有AK基因的E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml的卡纳霉素的LB培养基中培养。
当A600达到0.6-0.8时，用终浓度为0.2 mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时。
加裂解液后用超声破壁离心取上清，得到精氨酸激酶粗提液。
通过CM-Cellulose阳离子交换层析，Sephacryl TM-100凝胶过滤层析，Q-Sepharose阴离子交换层析分离纯化得到电泳纯的精氨酸激酶。
关键词：精氨酸激酶提取与纯化Extraction and Purification of Arginine KinaseAbstract： Arginine kinase（ATP：L-arginine phosphotransferase EC 2.7.3.3），plays an important role in cellular energy metabolism in invertebrate.E. coli Rosetta which contains recombinant AK gene was grown in LBmedium containing kanamycin (Final concentration: 25 μg/mL). Whenabsorbance at 600 nm value was between 0.6 with 0.8, isopropylβ-D-thiogalactopyranoside was added to 0.2 mM and the incubation wascontinued an addition 3 h. The cell was broken and centrifugated, thenthe crude cell extract was harvested. Furthermore it was purified byfollowing three methods in turn: CM-Cellulose positive ion exchangechromatography, Sephacryl TM-100gel filtrate chromatography, andQ-Sepharose anion exchange chromatography. A purified AK was foundto be homogenous by SDS poly -acrylaminde gel electrophoresis.Key words: arginine kinase extraction and purification1引言精氨酸激酶（AK）是一种磷酸原激酶，磷酸原是一种磷酸化的胍基化合物。
AK在体内催化如下反应：Mg2+ATP+Arg Mg2+ADP+Arginine phosphateAK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK。
虽然AK在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相同，但不同来源的AK在结构上表现出了非常大的多样性。
按照蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基AK，如海湾对虾中Penaeus aztecrs中提取的AK，相对分子量约为40KD，单亚基AK是目前研究最广泛的，本实验中我们所研究的AK就是单亚基，相对分子量为40KD。
2.海参Stichopusjaponicus中提取的AK为双亚基的蛋白质，相对分子质量约为84KD。
3.环节动物Sabellapavonina 中的AK具有四个亚基，分子量为150-160KD。
2实验材料以及实验试剂：2.1实验材料工程菌种：E．coli工程菌株Rossta2.2实验试剂LB培养基：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠，溶于950ml中，用NaOH调节pH至7.0，补加蒸馏水至总体积为1L，分装后高压蒸汽灭菌。
缓冲液：Buffer A：Tris 0.4 M、EDTA 1 mM、PMSF 25 μM、2-mercaptoethanol 10 mM、NaN3 5 μM，加入浓盐酸调pH 8.0；Buffer B：Tris 10 mM、EDTA 0.1 mM、2-mercaptoethanol 10 mM，加入浓盐酸调pH 8.0;贮存Buffer：Glycine 0.1 M，（NH4）2 SO4 3.2 M、2-mercaptoethanol 10 mM，加入NaOH 调至pH8.6;工作Buffer：Glycine 0.1M、2-mercaptoethanol 10mM，加入NaOH 调至pH8.6以上均为配制1L 溶液所需试剂量。
测活底物：57 mM Arg 2.0 ml、66 mM Mg(AC)2 2.0 ml、指示剂 2.0 ml、ATP 0.0532g，蒸馏水 14 ml加入NaOH调至pH8.2。
3实验方法3.1活化菌种取6支试管，各装有3 ml的LB液体培养基。
再各取工程菌种10 µl接入装有3 ml的LB液体培养基的试管（含有卡那青霉素，其工作浓度为50 µg/ml）中。
于37 ℃摇床振荡培养8-12小时。
3.2扩大培养取6支1L锥形瓶，各装300 ml LB培养基。
将试管中活化的1 ml菌液接种到300 ml LB培养基，同时加入300 µl卡那青霉素（终浓度50 µg/ml）培养基于37 ℃恒温培养箱中培养2-3小时。
3.3 IPTG诱导AK基因的表达实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加入IPTG诱导表达发现，当OD=0.6-0.8时，各加150 μl的 IPTG至终浓度为0.2 mM时AK的表达量达到最大。
3.4蛋白质提取（1）将上述各管于4 ℃，5000 r/m离心10 min；（2）弃上清，使沉淀物质重悬，每1 g沉淀加3 ml裂解液；（3）在冰上进行间隔为2秒钟的超声波破壁,直到沉淀变得澄清为止；（4）于4℃，12000 rpm，离心10 min，取上清，得到AK的粗提液。
3.5蛋白质的检测◆测定AK的活性：新鲜配制测活底物，保存于4℃取5 μl上清加入装有1mlAK底物塑料比色皿迅速混匀，通过紫外分光光度法测A575下降值◆ SDS-PAGE电泳[3.4]：（1）安装双垂直板电泳槽；（2）配12%的分离胶15ml，浓缩胶5ml；（3) 制样：取样品10 µ1加样品缓冲液以40µ1混合，100℃加热5 min ， 15000×g，4℃离心1 min；（4）上样：用微量注射器加样15-20 µ1；（5）电泳：在凝胶上加80 V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到140 V/cm继续电泳直到染料到达底部；（6）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热几分钟；（7）脱色：半小时更换一次脱色液，处理3-5次，直到胶板呈现淡蓝色。
3.6蛋白质的纯化（1）CMC阳离子交换层析平衡：3倍柱床体积Buffer A（pH=8.0）平衡上样：插A280滤光片，调A值、T值；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。
将粗提液34ml上柱，流速约为1.4ml/min。
洗脱：Buffer A (pH=8.0)洗柱，同时在280nm处进行连续紫外检测，收集洗脱峰。
（2）S-100凝胶过滤层析平衡：3倍柱床体积Buffer B 透析平衡上样：待插A280滤光片，调A值、T值；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。
稳定后将过CMC的洗脱液85 mL浓缩到50 mL 上柱，流速约1 ml/min。
洗脱：Buffer B (pH=8.0)洗柱，同时在280 nm处进行连续紫外检测，根据电脑监测波峰收集蛋白并留样测活、电泳。
（3）Q-Sepharose阴离子交换层析平衡：3倍柱床体积Buffer B 透析平衡上样：待插A280滤光片，调A值、T值；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。
稳定后将经过S-100处理的蛋白上柱，流速约1 ml/min。
洗脱：Buffer B (pH=8.0)洗柱将Buffer B溶液和1mol/L NaCl的Buffer B溶液各300mL于梯度混合仪的两容器中逐步混合由低浓度到高浓度进行洗脱蛋白。
流速0.98mL/min同时在280nm处进行连续紫外检测，设定每根收集试管收集流出蛋白时间，根据微电脑记录仪显示曲线，分别收集峰值的洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯化程度。
4结果与分析4.1蛋白质层析图谱图1-1. AK经CMC离子交换后的层析谱图如图1-1所示，由于CMC是阳离子交换树脂，而精氨酸（AK）在Buffer A（pH=8.0）下带负电荷，所以不被吸附在其上；带正电荷的杂蛋白会被吸附，因此可以我们得到的是一个主要由带负电荷形成的单一的峰。
图1-2 S-100凝胶层析谱图如图1-2 所示，将经CMC纯化后的蛋白溶液经浓缩，上样到分子筛S-100进一步分离纯化，得到几个洗脱峰。
分步收集每个峰的蛋白溶液进行活性检测，发现第一个峰含AK。
图1-3. AK经Q-sepharose离子交换后的层析谱图如图1-3 所示，将合并后的含AK蛋白溶液经Q－sepharose 纯化后得到如图，由于不同的蛋白在pH=8.0的BufferB缓冲液中所带电荷不同，与树脂的结合能力有差别，所以用盐进行洗脱时梯度时，会出现连续几个峰，所示结果。
活性检测显示第二个洗脱主峰含AK。
4.2 AK诱导表达电泳图1 2 3 4 5 MW(KD)2-1 AK经各步纯化与诱导表达对比电泳图1、经Q-sepharose离子交换后AK2、经S-100凝胶层析后AK3、经CMC离子交换后AK4、破壁后上清5、标准蛋白质5结果及讨论根据以上实验结果总结数据，我们计算得出在大肠杆菌Rossta中提取AK的各项得率如表5-1所示：Purification step V olume/mlTotalactivity/UTotalprotein/mgSpecificactivity/U·mg-¹PurificationfoldRecovery(％)上清 34 7309．32274．73 26．61 1 100 过CMC 85 6890．30235．98 29．20 1．10 94．27 过S-100 73 6373．78193．36 32．96 1．24 87．20 过Q 36．5 4393．1852．31 83．98 3．15 60．10表5-1由上表可以看出，在AK提取过程中，总的活力是逐级流失的，活力单位是递增的。