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第二节 遗传代谢性疾病的基因诊断
遗传代谢性疾病是指由于基因突变导致酶的质和量的 改变，从而所催化的酶促反应发生变化而引起的一系列疾
病。
一、代谢性疾病的特征及基因诊断策略
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基本流程：第1步
一个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶 混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、 Luciferase和三磷酸腺苷双磷酸酶Apyrase)和底物混合 物(包括腺苷酰硫酸APS和Luciferin)。
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双脱氧链终止法
原理: 测序基础是以ddNTP为
测序反应的链终止剂 掺入到延伸链中的
ddNTP可阻止后续ddNTP 或dNTP的掺入
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示例：BigDye™ Terminators 循环测序反应扩增到未端为BigDye™ Terminators的
基本流程：第2步
向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的 下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到 测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。
(DNA)n+dNTP
聚合酶
(DNA)n+1+PPi
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基本流程：第3步 在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形
继发性代谢性疾病是由其它原发性疾病导致的代 谢性疾病，如糖尿病导致的继发性高脂血症。
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二、代谢性疾病的诊断手段
过去：主要依靠与物质代谢相关的各种酶的 生物化学方面的诊断
现在：生化诊断+基因诊断
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基因诊断的概念
基因诊断就是利用现代 分子生物学和分子遗传学的 技术方法,直接检测基因结 构及其表达水平是否正常, 从而对疾病作出诊断的方法。
基本原理是根据在电场作用下离子迁移 的速度不同而对组分进行分离和分析。
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变性高效液相色谱(DHPLC)是一种新的 高通量筛选DNA序列变异的技术，其原 理是利用离子对反向高效液相色谱原理, 通过一个DNA分离柱，进行核苷酸片段 的分离和分析。
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四、基因芯片技术
卫生部“十一五” 规划教材
全国高等医药教材建设研究会规划教材
第十九章 遗传代谢性疾病 的基因诊断
第三军医大学 府伟灵 黄庆
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主要内容
前言 一、基因诊断技术 二、遗传代谢性疾病的基因诊断
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2
前言
细胞、组织、器官和机体的生存与功能维持都必须 依赖不断进行的物质代谢过程。
物质代谢包括合成代谢及分解代谢两个过程。 代谢性疾病是物质代谢过程的紊乱，多为酶或蛋白
ATP双磷酸酶
dNDP+dNMP+Pi
ATP
ATP双磷酸酶 ADP+AMP+Pi
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基本流程：第5步 加入另一种dNTP，使
第2－4步反应重复进 行，根据获得的峰值 图即可读取准确的DNA 序列信息
DNA 序列
GC-Fra bibliotekAGG CC T
G
C
T
A
G
C
T
核苷酸递增
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焦磷酸盐测序法步骤
基因芯片技术就是指将大量特定的靶基因片段 或寡核苷酸片段作为探针有序和高密度地排列 固定于玻璃和硅等固相载体上，然后检测与待 测的不同荧光标记样品基因按碱基配对的原理 进行杂交，通过激光共聚焦系统检测探针分子 的杂交信号强度，经计算机分析处理数据资料， 获取不同样品分子的数量和大量生物信息，从 而可对基因序列及功能进行大规模和高通量的 研究。
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A
B
DNA Polymerase
ACCTTGAATTCGTCCTAGGA…… GGATCTT……
TT AA
dNTP Apyrase
(d)NMP
PPi ATP-sulphurylase
ATP Luciferase
Light
C
T
GC
A G TC A G TC AG TC A G TC
一系列的核苷酸链。
循环测序反应产物经沉淀、洗涤和纯化，从而去除多 余的未反应的BigDye™ Terminators。
电泳与结果分析。
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焦磷酸测序技术
原理: 引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫
酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等4种酶 的协同作用下，将每一个dNTP的聚合与一次荧光信 号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度， 以荧光信号的形式实时记录模板DNA的核苷酸序列。
成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光 素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学 系统即可获得一个特异的检测峰，峰值高低则和相匹配 的碱基数成正比。
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基本流程：第4步
反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作 用下发生降解。
dNTP
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基因诊断的特点
针对性强 特异性高 灵敏度高 适用性强 诊断范围广
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第一节 基因诊断技术
一.DNA测序技术 二.聚合酶链反应技术 三.毛细管电泳技术 四.基因芯片技术
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一、DNA测序技术
所有生物基因组序列的数 据均来自 DNA 测序 特点: 稳定简便 自动化程度高 数据准确可靠 公认为国际金标准
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二、聚合酶链反应技术
PCR是体外酶促合成特异 DNA片段的方法。
四种主要成分： DNA模板、引物、DNA 聚合酶和dNTP。
三个反复步骤： 高温变性、低温退火和 适温延伸。
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三、毛细管电泳技术
毛细管电泳统指以高压电场为驱动力， 以毛细管为分离通道，依据试样中各组 分间淌度和分配行为上的差异来实现分 离的一类分离技术。
异常所致。 根据代谢性疾病的病因，可将其分为原发性和继发
性。
一、代谢性疾病的分类
二、代谢性疾病的诊断手段
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一、代谢性疾病的分类
原发性代谢性疾病： 又叫先天性代谢性疾病。是指当编码物质代谢所
需酶或蛋白的基因发生突变、不能合成或合成了无活 性的产物时，就会导致有关代谢途径不能正常运转， 造成具有不同临床表型的各种代谢缺陷病。 继发性代谢性疾病：