细胞周期时相分析
仪器、材料与试剂 仪器、
仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱 仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴， 材料：HeLa细胞，5ml注射器，离心管，封口膜，微量移液器，Tips 细胞， 注射器， 材料：HeLa细胞 5ml注射器 离心管，封口膜，微量移液器， 试剂：70％乙醇（保存于4℃），RNase-A （10mg/ml,-20℃保存）， 4℃），RNase10mg/ml,-20℃保存 保存）， 试剂：70％乙醇（保存于4℃），RNase
PI （650µg/ml，避光保存于-20℃），PBS(pH 7.4，保存于4℃) 650µg/ml，避光保存于-20℃）， ），PBS(pH 7.4，保存于4℃)
细胞周期时相分析
实
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取对数生长期细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞， 取对数生长期细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹 min去上清 去上清。 打，800rpm , 离心 15 min去上清。 PBS洗 PBS洗2次，加0.5mL PBS吹匀，务必吹散。 PBS吹匀 务必吹散。 吹匀， 用5mL注射器将细胞吸起，用力打入5mL 70%(预冷)乙醇中，封口 5mL注射器将细胞吸起 用力打入5mL 70%(预冷 乙醇中， 注射器将细胞吸起， 预冷) 膜封口。 固定过夜（可长至2 膜封口。4℃固定过夜（可长至2周） 800rpm 15min收集固定细胞，PBS洗2次 15min收集固定细胞 PBS洗 收集固定细胞， 用0.4mL PBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打（防止细胞破碎） PBS重悬细胞并转至 重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打 防止细胞破碎） 中轻轻吹打（ 加RNase-A约3µL至终浓度约为50µg/mL ，37℃水浴消化30 min； RNase3µL至终浓度约为 至终浓度约为50µg/mL 37℃水浴消化30 min； 加PI约50µL至终浓度约为65µg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。 PI约50µL至终浓度约为 至终浓度约为65µg/mL 在冰浴中避光染色30 min。 用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，上机检测 300目 孔径40~50微米 尼龙网过滤， 微米） 样品分析测定及打印
实验 利用流Βιβλιοθήκη 细胞 术分析细胞周期时相细胞生物学实验
流式细胞术分析细胞周期时相
• 实验目的 • 实验原理 • 仪器、材料与试剂 仪器、 • 实验步骤 • 实验报告及思考题
实
验
目
的
掌握流式细胞仪的工作原理 掌握用流式细胞仪测量细胞群体DNA 掌握用流式细胞仪测量细胞群体 DNA 含量分布的方法 了解流式细胞术在细胞生物学研究中 的应用
细胞周期时相分析
实验报告及思考题
实验报告
标明你所测定的样品中各周期时相的百分比？ 标明你所测定的样品中各周期时相的百分比？
思考题
1. 2.
流式细胞术在科学研究中的应用 本实验为何要采用对数生长期的细胞？ 本实验为何要采用对数生长期的细胞？
细胞周期时相分析
细胞周期时相分析
实
验 原 理
流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下 流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中， 进入充满鞘液的流动室。 进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷 形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测， 出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得 到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、 到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋 白质、抗原等物理及化学特征。 白质、抗原等物理及化学特征。 细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化， G0/G1期的 细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化 期的DNA 含量为2C 2C， G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法， 期的DNA含量是4C PI标记的方法 含量为2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法，通过流式细胞仪 对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。 DNA的相对含量进行测定 对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。